水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）載體在研究病毒顆粒入侵宿主細胞、辨認介導病毒感染細胞的細胞表面受體、篩選病毒抑制藥物以及疫苗開發(fā)方面有著廣泛的應用。VSV病毒載體可以高效地利用異源病毒的包膜蛋白進行假型化（Presudotypted），比如那些需要在高生物安全等級實驗室操作的病毒的包膜蛋白。重組VSV在宿主細胞中不能進行超過一輪的復制，因此可以在生物安全2級（BSL2）實驗室進行相關(guān)操作。這些特點促使VSV病毒載體成為在無需高度隔離下研究高風險病毒侵入細胞機制的理想選擇。

野生型VSV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），擁有一條單鏈負義RNA基因組，并且其復制依賴病毒的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。VSV的單鏈RNA基因組編碼以下五種蛋白組分：核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RdRp的大亞基（L）。VSV病毒顆粒中，其RNA基因組與N核蛋白組成核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）。P和L蛋白則組成RdRp，并結(jié)合于RNP。VSV感染靶細胞時，其G糖蛋白誘導細胞發(fā)生內(nèi)吞作用，幫助病毒侵入細胞。G糖蛋白可以介導病毒包膜與細胞膜融合，促使RNP和RdRp一起釋放到細胞質(zhì)中。病毒組分進入細胞后，RdRp以RNP中的負義RNA基因組為模板立即啟動一級轉(zhuǎn)錄，而作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正義RNA鏈被進一步翻譯，用于生產(chǎn)介導病毒基因組復制、二級轉(zhuǎn)錄、病毒組裝和出芽等病毒等功能的后期蛋白。

載體家生產(chǎn)的重組VSV是G糖蛋白基因缺失的，該缺失導致VSV自我復制缺陷的。G糖蛋白基因通常被替換為報告基因（如熒光蛋白基因、熒光素酶報告基因或分泌型堿性磷酸酶基因）用于病毒的轉(zhuǎn)導效果測定。生產(chǎn)VSV假病毒主要由三個步驟構(gòu)成：1. 使用質(zhì)粒初步制備VSV；2. 擴增G糖蛋白補全的VSV；3. 使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒。進行重組VSV初步制備時，首先利用大腸桿菌構(gòu)建一個可轉(zhuǎn)錄編碼VSV基因組的負義RNA鏈的VSV-ΔG轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為RdRp合成病毒RNA的RNA模板。該載體與四個輔助載體（分別表達VSV N、P、G和L蛋白）共轉(zhuǎn)染至經(jīng)牛痘病毒接種的表達噬菌體T7 RNA聚合酶的包裝細胞。T7 RNA聚合酶作用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上的T7啟動子，驅(qū)動VSV-ΔG基因組轉(zhuǎn)錄出負義RNA。重組VSV在包裝細胞中組裝并釋放。收集細胞上清，用其再次感染表達有G糖蛋白的包裝細胞，獲得高產(chǎn)量的G糖蛋白補全的重組VSV。VSV假病毒隨后通過轉(zhuǎn)導G糖蛋白補全的VSV至表達有異源病毒包膜蛋白的包裝細胞的方式制備。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的VSV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒刪除了VSV的G糖蛋白基因，因此可通過提供異源病毒包膜糖蛋白的順式元件來組裝VSV假病毒。VSV病毒的細胞嗜性取決于其包膜蛋白的類型。經(jīng)過專門優(yōu)化，我們的VSV轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中以高拷貝數(shù)方式復制，并含有報告基因以用于VSV假病毒感染靶細胞后的轉(zhuǎn)導效果測定。

病毒滴度高：我們的VSV載體可用于包裝滴度高達>10⁸ PFU/ml 的VSV病毒。該滴度范圍的VSV病毒感染體外哺乳動物細胞時，足量病毒可以獲得100%的轉(zhuǎn)導效率。

生產(chǎn)上易于擴增：重組VSV可以很方便地幾乎在所有類型的哺乳動物細胞中進行擴增制備。

安全性高：重組VSV只能在宿主細胞中進行一輪復制。使用VSV假病毒可以安全地在BSL-2設施中研究高風險病毒（如伊波拉病毒、寨卡病毒、尼帕病毒、新冠病毒等）的包膜蛋白。

適用于疫苗研發(fā)：VSV可以引發(fā)體液和細胞免疫，毒性很低，并且在人類群體中只有很低的血清陽性率。重組VSV是理想的用于研制人類疫苗的病毒載體。

載體容量有限：VSV基因組長度為11 kb，超出該尺度的長片段基因或多基因插入將降低病毒包裝后的病毒滴度，不利于后續(xù)應用。

不適用于研究病毒的傳染病模型：由于重組VSV只能在宿主細胞內(nèi)復制一次，因此對于實際的病毒感染機體過程的反映能力相當有限。

技術(shù)復雜：生產(chǎn)重組VSV有相當多的中間步驟，包括從質(zhì)粒初步制備VSV、斑塊純化、生產(chǎn)G糖蛋白補全的VSV、使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒等。這些步驟相對于傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染要求運用到更復雜的技術(shù)。

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It can drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA in packaging cells.

T7 promoter: Promoter from T7 bacteriophage. The T7 RNA polymerase from the phage recognizes this promoter to drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA.

VSV-N: Nucleoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Assembles into an intact RNase-resistant nucleocapsid as N/RNA polymer; required for initiating viral genome synthesis.

VSV-P: Phosphoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Functions as a critical component of the VSV polymerase complex by positioning the large (L) protein on the N/RNA template and stimulating viral RNA synthesis with the L protein at both the initiation and elongation steps.

VSV-M: Matrix protein gene of vesicular stomatitis virus. Associates with the N/RNA nucleocapsid and facilitates virus assembly by promoting condensation of the ribonucleocapsid.

Kozak: Kozak translation initiation sequence. Facilitates translation initiation of ATG start codon downstream of the Kozak sequence.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

VSV-L: Large polymerase protein gene of vesicular stomatitis virus. Forms RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complexes with the VSV phosphoprotein and catalyzes synthesis of the N, P, M, G, L mRNAs sequentially.

HDV: Hepatitis delta virus (HDV) antigenome self-cleaving ribozyme. This ribozyme, when present in the transcript, catalyzes the self-cleavage of the transcript in cis.

T7 terminator: Transcriptional termination signal from T7 bacteriophage. Allows transcription termination of RNA transcribed by bacteriophage T7 RNA polymerase.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. Transcription driven by the CMV promoter is terminated within this sequence.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.